เทคโนโลยีเปปไทด์ FRET

การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสง (FRET)

การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสง (FRET) เป็นกระบวนการถ่ายโอนพลังงานแบบไม่แผ่รังสี ซึ่งพลังงานสถานะตื่นเต้นของผู้บริจาคจะถูกถ่ายโอนไปยังสถานะตื่นเต้นของผู้ยอมรับผ่านอันตรกิริยาของคู่ไฟฟ้าระหว่างโมเลกุลกระบวนการนี้ไม่เกี่ยวข้องกับโฟตอน ดังนั้นจึงไม่มีการแผ่รังสีการทดสอบนี้มีข้อดีคือรวดเร็ว ละเอียดอ่อน และเรียบง่าย

สีย้อมที่ใช้ในการทดสอบ FRET สามารถเหมือนกันได้แต่ในการใช้งานส่วนใหญ่ จริงๆ แล้วจะใช้สีย้อมที่แตกต่างกันโดยสรุป การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์การส่องสว่างคือการถ่ายโอนไดโพลคู่จากผู้บริจาค (สีย้อม 1) ไปยังตัวรับ (สีย้อม 2) เมื่อกลุ่มผู้บริจาครู้สึกตื่นเต้นโดยทั่วไป สเปกตรัมการแผ่รังสีของกลุ่มผู้บริจาคฟลูออโรฟอร์จะทับซ้อนกับสเปกตรัมการดูดกลืนแสงของกลุ่มตัวรับ“เมื่อระยะห่างระหว่างฟลูออโรฟอร์ทั้งสองอย่างเหมาะสม (10 — 100 A) จะสามารถสังเกตการถ่ายโอนพลังงานฟลูออโรฟอร์จากผู้ให้ไปยังผู้รับได้”วิธีการถ่ายโอนพลังงานขึ้นอยู่กับโครงสร้างทางเคมีของตัวรับ:

1. ถูกแปลงเป็นการสั่นสะเทือนของโมเลกุล กล่าวคือ แสงส่องสว่างจากการถ่ายโอนพลังงานจะหายไป(ตัวรับเป็นตัวดับแสง)

2. การแผ่รังสีมีความเข้มข้นมากกว่าตัวรับ ส่งผลให้สเปกตรัมแสงทุติยภูมิมีการเลื่อนไปทางสีแดง”(ตัวรับเป็นตัวปล่อยแสง)

กลุ่มผู้บริจาค (EDANS) และยีนตัวรับ (DABCYL) เชื่อมโยงกันอย่างสม่ำเสมอกับสารตั้งต้นตามธรรมชาติของโปรตีเอส HIV และเมื่อไม่ได้แยกสารตั้งต้นออก DABCYL ก็สามารถดับ EDANS และจากนั้นจะไม่สามารถตรวจพบฟลูออรีนได้เมื่อขาดการเชื่อมต่อโปรตีเอส HIV-1 EDANS จะไม่ถูกดับโดย DABCYL อีกต่อไป และต่อมาสามารถตรวจพบ EDANS liferases ได้ความพร้อมใช้งานของสารยับยั้งโปรติเอสสามารถตรวจสอบได้โดยการเปลี่ยนแปลงความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ของ EDANS

เปปไทด์ FRET เป็นเครื่องมือที่สะดวกในการศึกษาความไม่เฉพาะเจาะจงของเปปติเดสเนื่องจากสามารถตรวจสอบกระบวนการทำปฏิกิริยาได้อย่างต่อเนื่อง จึงเป็นวิธีที่สะดวกในการตรวจจับการทำงานของเอนไซม์ความเงาที่เกิดขึ้นหลังจากการไฮโดรไลซิสของพันธะเปปไทด์โดยผู้บริจาค/ผู้รับ จะช่วยวัดการทำงานของเอนไซม์ที่ความเข้มข้นระดับนาโนโมลาร์เมื่อเปปไทด์ FRET ไม่บุบสลาย มันแสดงให้เห็นการหายไปอย่างกะทันหันของแฟลชภายใน แต่เมื่อพันธะเปปไทด์ที่อยู่ตรงข้ามกับผู้ให้/ผู้รับแตกออก มันจะปล่อยแฟลชออกมา ซึ่งสามารถตรวจจับได้อย่างต่อเนื่อง และจากนั้นก็สามารถตรวจวัดการทำงานของเอนไซม์ได้